植物根际促生菌（PGPR）分离、鉴定与功能评价
植物根际促生菌（PGPR）的难点从来不是“分到菌”，而是“测得准”。同一株菌，定性平板上有溶磷圈、换成定量体系可能只有几 mg/L；ACC 脱氨酶用 DF 培养基初筛阳性、复测却掉到检出限以下。本服务从根际土样的盐梯度定向富集开始，到 8 项促生性状的定量复测结束，交付的是能直接写进论文、能支撑菌肥配方的功能谱数据，而不只是一份菌种名单。
一、服务概述
武汉锐志魔方生物依托标准化、可追溯的微生物分离与功能评价体系，为高校、科研院所及农业生物企业提供植物根际促生菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR）的分离筛选、菌种鉴定与多指标促生功能评价定制服务。全部流程在自有实验室完成，菌株编号、原始数据与照片同步留存，可追溯、可复核。
本方案特别适配盐碱地及盐生植物根际微生物资源挖掘：采用含 1%–10% NaCl 的改良 Gibbons 培养基进行梯度富集，按目标样地的实际含盐量设定富集浓度，定向筛选兼具耐盐碱特性与促生能力的菌株，直接服务于微生物肥料、生物有机肥及盐碱地改良菌剂的开发。
为什么是“盐梯度”而不是“高盐”
直接用最高盐浓度做富集，会把“中等耐盐、但促生活性更强”的菌株整批筛掉——这是盐碱地菌株挖掘最常见的损失。本服务按 1% / 3% / 5%（可按样地含盐量上探至 10%）三档平行富集，保留耐盐谱的宽度，最后交付的功能谱里能同时看到“耐盐上限”和“促生活性”两个维度，据此判断菌株适合落在哪一档盐碱地。
二、技术路线
抖根法取根表土，去除石块与大块根系，梯度稀释制备菌悬液
改良 Gibbons 培养基，1%/3%/5% NaCl 三档平行富集 3–7 d，涂布分离
按形态差异挑取，划线纯化 2–3 代，镜检确认纯度
16S rRNA 全长扩增（27F/1492R）双向 Sanger 测序，比对 + 系统发育树；−80 °C 甘油管保藏
定性平板初筛 + 定量体系复测，两项结果并列写入报告
菌株 × 指标功能矩阵、聚类分析与后续开发建议
三、核心功能评价指标
8 项指标全部做“定性初筛 + 定量复测”两级判读。只报“有/无”的结果无法比较菌株优劣，也无法在文章中支撑“促生能力”这一表述；定量值同时给出测定条件，便于复核。
| 功能指标 | 测定方法 | 结果形式 | 评价意义 |
|---|---|---|---|
| ACC 脱氨酶 | ACC 唯一氮源法（DF 培养基对照 + 酶活定量） | 定量（µmol α-酮丁酸·mg⁻¹ 蛋白·h⁻¹） | 裂解乙烯前体 ACC，缓解盐害与逆境胁迫，促进根系伸长 |
| 产 IAA | L-色氨酸诱导 + Salkowski 比色（530 nm） | 定量（µg/mL） | 生长素类促生，促进侧根与根毛发育 |
| 解钾 | Aleksandrov 培养基培养 + 火焰光度法测可溶性钾 | 定量（mg/L 钾释放量） | 活化矿物钾与缓效钾，提高钾素有效性 |
| 产 EPS（胞外多糖） | 醇沉 + 苯酚-硫酸法（490 nm） | 定量（mg/L） | 保水、成膜、固沙，改善根际微环境与抗旱能力 |
| 固氮能力 | Ashby 无氮平板生长 + 无氮液体培养全氮测定 | 定性 + 定量（mg/L 总氮增量） | 生物固氮，为植物提供可利用氮源 |
| 解无机磷 | 无机磷平板溶磷圈（Ca₃(PO₄)₂）+ 钼锑抗比色 | 定性（D/d 比值）+ 定量（mg/L 可溶磷） | 活化难溶磷酸钙，提高磷素有效性 |
| 解有机磷 | 卵磷脂有机磷平板溶磷圈 + 钼锑抗比色 | 定性（D/d 比值）+ 定量（mg/L 可溶磷） | 矿化有机磷，释放可利用磷 |
| 产铁载体 | CAS 检测液（A/Ar 比值） | 半定量（铁载体单位 SU %） | 螯合铁，抑制病原菌定殖，改善植物铁营养 |
D/d = 溶磷圈直径 / 菌落直径；SU % =（Ar − As）/ Ar × 100，Ar 为对照吸光度、As 为样品吸光度。所有定量项目均设 3 重复并扣除空白，原始读数随报告交付。
四、样品要求与送样
| 样本类型 | 建议量 | 保存与运输 | 备注 |
|---|---|---|---|
| 根际土 / 根表土 | 50–100 g | 4 °C 冷藏，7 d 内寄达；不建议冷冻 | 抖根法采集，去除石块与大块根系；建议 3 个样点混合或分别标记 |
| 新鲜根段（内生菌） | 5–10 g | 4 °C，48 h 内处理 | 表面消毒后分离，需在委托单注明“内生菌” |
| 根际菌悬液 | 5–10 mL | 4 °C | 须注明稀释倍数与悬浮介质 |
| 已纯化菌株（仅做功能评价） | 平板 / 甘油管各 1 份 | 常温或 4 °C | 我方复壮后测，需提供菌株编号与培养条件 |
盐碱地样品建议同时提供土壤含盐量与 pH；不提供也可以，我方测土后据此设定富集梯度（该项不额外收费，但会延长 3–5 个工作日）。
五、项目流程与周期
| 阶段 | 内容 | 周期 |
|---|---|---|
| S1 方案与富集 | 盐梯度设计、培养基配制、定向富集 | 1–2 周 |
| S2 分离与纯化 | 平板分离、挑单菌落、划线纯化 2–3 代 | 2–3 周 |
| S3 鉴定与保藏 | 16S 全长测序、序列比对、系统发育分析、甘油管保藏 | 1–2 周 |
| S4 功能评价 | 8 项指标定性初筛 + 定量复测 | 2–4 周 |
| S5 报告交付 | 功能谱矩阵、数据分析、综合报告 | 1 周 |
常规项目合计 6–10 周。菌株数量、指标数量、是否含定量复测三项会明显影响周期；只做功能评价（菌株由客户提供）通常 3–4 周完成。
六、交付标准
- 分离菌株：数量按项目需求定制（常见 20 / 50 / 100 株档），每株 2 支甘油管（−80 °C）+ 1 块新鲜平板；
- 鉴定结果：16S rRNA 全长序列、最相近模式株及相似度、系统发育树；相似度低于 98.7% 时明确提示“可能为新种”，并给出确认方案；
- 功能数据：8 项指标的原始读数、判读结果与实验照片，定性、定量分列；
- 功能谱矩阵：菌株 × 指标的汇总表，可直接用于论文补充材料与菌株比较；
- 菌保：各分离株甘油菌冻存管，编号与分离来源一一对应；
- 综合报告：分离鉴定流程、功能谱评价、优良菌株推荐及后续开发建议。
可选加项：序列 GenBank 登录号申请、菌株全基因组测序与 ANI 定种（用于新种发表或专利菌株确权）。
七、技术优势
- 功能谱全覆盖：耐盐碱、固氮、溶无机磷、溶有机磷、解钾、IAA、ACC 脱氨酶、EPS、铁载体等经典 PGPR 性状一次做完，避免分批送样造成的条件漂移；
- 定量优先：所有可定量指标均给数值与测定条件，不停留在“有/无”的定性判读；
- 方法学有据：Salkowski 比色、CAS 铁载体检测、Ashby 固氮、钼锑抗比色等关键方法均参照已发表文献执行，结果可复核（见第十一节）；
- 盐碱地专长：依托自有嗜盐菌培养与耐盐评价经验，1%–10% NaCl 梯度富集与耐盐上限测定可在同一批次内完成；
- 标准化交付：从涂布、纯化到测序、保藏全流程 SOP 化，菌株编号唯一、原始数据留存，可追溯；
- 与下游打通：鉴定出的菌株可直接对接我方的遗传改造（敲除 / 过表达 / 荧光标记）、全基因组测序与菌剂小试，不必换供应商重做适应性验证。
八、结果展示
九、可选延伸模块
| 模块 | 内容 | 适用场景 |
|---|---|---|
| 全基因组测序与 ANI 定种 | 二代/三代测序、组装、ANI 与 dDDH 计算、次级代谢基因簇预测 | 新种发表、专利菌株确权、安全性初筛 |
| 菌株遗传改造 | 基因敲除、过表达、荧光/抗性标记、启动子替换 | 促生机制研究、根际定殖示踪 |
| 拮抗与生防评价 | 平板对峙、抑菌圈、发酵上清抑菌活性 | 兼有防病功能的菌株筛选 |
| 菌剂小试 | 液体发酵、活菌数（CFU/mL）测定、助剂配伍与存活率 | 菌肥配方开发前期 |
十、合作与联系
武汉锐志魔方生物诚邀各高校课题组、科研院所及农业生物企业就根际微生物资源挖掘、微生物肥料菌株筛选开展合作，提供免费可行性评估与项目报价。可先寄少量样品做预实验，确认分离与功能检出情况后再确定正式方案。
如需正式报价，请提供：目标作物与土壤类型（是否盐碱）、样品数量与类型、期望菌株数、需要的功能指标、是否需要定量复测与全基因组测序。资料齐全时 1 个工作日内给出方案与报价。
十一、参考文献
- Schwyn B, Neilands J B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry, 1987, 160(1): 47–56.
- Penrose D M, Glick B R. Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteria. Physiologia Plantarum, 2003, 118(1): 10–15.
- Glickmann E, Dessaux Y. A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(2): 793–796.
- Gordon S A, Weber R P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid. Plant Physiology, 1951, 26(1): 192–195.
- Nautiyal C S. An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms. FEMS Microbiology Letters, 1999, 170(1): 265–270.
- Dubois M, Gilles K A, Hamilton J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry, 1956, 28(3): 350–356.
- Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A, et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal of Bacteriology, 1991, 173(2): 697–703.
- Egamberdieva D, Wirth S, Bellingrath-Kimura S D, et al. Salt-tolerant plant growth promoting rhizobacteria for enhancing crop productivity of saline soils. Frontiers in Microbiology, 2019, 10: 2791.