细菌活死荧光染色（SYTO 9 / PI）

细菌活死荧光染色是快速评估药物杀菌效果与生物膜结构完整性的直观方法。利用 SYTO-9（绿色荧光核酸染料，可透过完整细胞膜）与 PI（碘化丙啶，仅进入膜受损细胞）的竞争性染色，完整膜细菌呈绿色荧光，受损/死菌呈红色荧光，结合荧光显微镜或 CLSM 可获得空间分布信息。

一、染色原理

  • SYTO-9：绿色荧光染料，可标记所有细菌（完整膜与受损膜）；
  • PI：红色荧光染料，只能进入膜受损细胞，且插入后会降低 SYTO-9 荧光；
  • 结果判读：完整膜细菌呈绿色，膜受损/死菌呈红色，混合群体呈黄/橙色。
大肠杆菌活死染色
图 1　大肠杆菌活死相关染色（SYTO-9/PI）：左为活菌（绿色），中为死菌（红色），右为混合群体。

二、CLSM 三维活死染色

对于生物膜等三维结构，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）可进行 Z-stack 层扫并重建三维图像，直观展示药物处理后生物膜不同深度的活菌与死菌分布，是验证 BIC/BEC 与杀菌动力学的强有力手段。

幽门螺杆菌三维活死染色
图 2　幽门螺杆菌生物膜活死相关染色三维重建（FITC-ConA/PI）：绿色为活菌区，红色为死菌区，可观察药物渗透与杀菌深度。

三、应用场景

  • 快速判定药物杀菌率与作用时间；
  • 生物膜内活 / 死菌空间分布与厚度分析；
  • 医疗器械表面抗菌涂层效果验证；
  • 与 CFU 计数、XTT 活性法相互印证。

四、参考文献

  • Stiefel P, et al. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiol, 2015.
  • Gião M S, et al. Validation of SYTO 9/propidium iodide uptake for rapid detection of viable but noncultivable Legionella pneumophila. Microb Ecol, 2009.

典型项目经验

药物处理后细菌活死比例
样品：浮游菌或生物膜 方法：SYTO 9 / PI 染色 + 荧光计数 交付：活/死比例与成像图
生物膜 CLSM 三维活死分析
样品：体外生物膜模型 方法：Z-stack 层扫 + 三维重建 交付：三维分布图与厚度/死菌占比分析
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