幽门螺杆菌（H. pylori）抑菌与药效评价

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是典型的微需氧苛养菌：生长慢、菌落半透明针尖状、液体培养 OD 值极低，常规 96 孔肉汤稀释＋浊度判读在这里并不好用。锐志魔方基于自有标准菌株与固体含药培养体系，提供琼脂稀释与刃天青显色双路径 MIC，并构建「体外抑菌定量 → 胃上皮细胞侵染 → SS1 小鼠定植模型」的分层评价体系，为抗菌药物、抗菌肽、天然产物与胃部护理材料的研发提供从高通量筛选到体内验证的可追溯数据。

一、背景：为什么需要专门的体外抑菌评价

Hp 定植于胃黏膜，是慢性胃炎、消化性溃疡的重要病因，1994 年被 WHO 下属国际癌症研究机构（IARC）列为Ⅰ类致癌原；据系统综述估计，全球约半数人口感染。抗菌药物耐药是根除失败的首要原因：WHO 六大区域几乎所有成员国中，Hp 对克拉霉素、甲硝唑与左氧氟沙星的耐药率均已超过 15%。WHO 曾在 2017 年抗生素耐药重点病原体清单中将「克拉霉素耐药 Hp」列为高优先级（2024 版按分类群精简后未再单列），国内外共识亦强调耐药监测与药敏指导下的个体化选药。

与之对应，新型抗菌化合物、抗菌肽、天然产物、口腔与胃部护理材料、医疗器械涂层在研发早期都需要可复现的 Hp 体外活性数据。这类数据必须建立在对 Hp 培养特性的适配之上，而不能直接套用大肠杆菌、金葡菌的标准流程。

二、基础培养与菌株鉴定

我司具备稳定的 Hp 培养经验，库存标准菌株 ATCC 26695 与 SS1 均经 16S rRNA 一代测序确认种属无误，可作为每批次试验的参比与质控起点。其中 26695 是 1997 年首个完成全基因组测序的 Hp 菌株（环状基因组 1,667,867 bp、1,590 个预测编码序列）；SS1（Sydney strain 1）为 cagA / vacA 阳性、可在 C57BL/6 小鼠胃内稳定高定植的标准动物模型株，适合体内外数据关联。培养采用含血固体培养基，37 °C、5% O₂ / 10% CO₂ / 85% N₂ 微需氧环境，通常培养 3–5 天后判读；配合菌落形态、革兰染色及尿素酶 / 氧化酶 / 过氧化氢酶反应完成鉴定。SS1 同时作为体内定植模型的标准株（见第八节）。

幽门螺杆菌血平板分区划线复苏 — 图 1　含血平板分区划线复苏：Hp 生长缓慢，需在微需氧条件下培养数日方可判读。

幽门螺杆菌半透明针尖状菌落 — 图 2　Hp 菌落呈半透明针尖状（箭头所示），肉眼不易观察，需借助斜射光仔细判读。

三、MIC 测定（一）：固体含药二倍稀释法

Hp 菌落半透明、液体培养时 OD 值非常低，以吸光度判定生长终点容易漂移或出现假阴性。因此本服务采用固体含药二倍稀释法（琼脂稀释法）：将药物按二倍梯度加入固体培养基，定量点种菌悬液后微需氧培养，直接以「是否形成可见菌落」判读，完全抑制可见生长的最低药物浓度即为 MIC。原始记录以框线区分有生长的对照孔 / 低浓度含药孔与未见生长的含药孔，结果直观、可追溯，也便于识别耐药亚群与杂菌污染。

方法学上参考 CLSI M45（少见菌与苛养菌抗菌药物稀释 / 扩散法）与 EUCAST 体系：CLSI M45 将琼脂稀释法列为 Hp 克拉霉素药敏的参考方法，其判读折点为 MIC ≤ 0.25 mg/L 敏感、0.5 mg/L 中介、≥ 1.0 mg/L 耐药；EUCAST 则采用 S ≤ 0.25 / R > 0.25 mg/L。两套体系折点并不相同，凡需给出 S / R 结论的项目，须在方案阶段明确所采用的标准与版本；本服务默认报告实测 MIC 数值与原始记录。当候选物数量多、样品量有限，或需要同时比较多个「浓度 × 菌株」组合时，可改用下一节的刃天青显色微量稀释法做高通量筛选，再以本节的琼脂稀释法复核关键结果。

图 3　固体含药二倍稀释法含药琼脂块阵列：每一格对应一个药物浓度，以是否形成可见菌落判读 MIC。

四、MIC 测定（二）：刃天青显色法 96 孔板微量稀释

琼脂稀释法需按浓度逐块倒平板，样品消耗与工时随候选物数量线性增长。对早期批量筛选，可采用刃天青（resazurin，商品名 Alamar Blue）显色的肉汤微量稀释法：刃天青为蓝紫色、几乎无荧光的氧化态染料，被活菌代谢产生的还原力（NAD(P)H 依赖的脱氢酶 / 还原酶）不可逆还原后生成粉红色、强荧光的试卤灵（resorufin）；若还原过度或孵育过久，还会继续转为无色、无荧光的二氢试卤灵（dihydroresorufin）。因此用「蓝紫 → 粉红」的颜色跃迁即可判定孔内是否存在代谢活性，不必依赖 Hp 极低的培养浊度，也可用酶标仪在约 570 nm 比色或 530–570 / 580–590 nm 荧光定量。

典型流程：在 96 孔板内以 BHI（补充血清 / 酵母提取物等）配制二倍浓度梯度的受试物，接入标准化菌悬液（文献常用 10⁵–10⁶ CFU/mL 量级），37 °C、5% O₂ / 10% CO₂ / 85% N₂ 微需氧培养 48–72 h；随后加入过滤除菌的刃天青（文献常用终浓度约 0.01 mg/mL，或按试剂说明加入 10% 体积的 Alamar Blue），继续孵育 1–6 h 后判读，能阻止蓝紫色向粉红转变的最低药物浓度即为 MIC。每块板须设生长对照（应转粉红）、无菌 / 培养基空白（应保持蓝紫）、溶剂对照、阳性药对照，以及「受试物＋染料＋无菌培养基」的颜色 / 还原空白；显色后可取未变色孔内容物转种血平板，用可复苏菌落数复核 MIC 并继续测 MBC。需特别固定接种量与显色时间——Sarker 等指出，早期方案在倍比稀释时同时稀释了菌悬液，导致并非「真正的 MIC」，故每孔必须接入等量的标准化菌液。

方法定位与干扰控制：刃天青法读取的是代谢活性而非活菌数，适合批量初筛、天然产物 / 抗菌肽 / 复方配比的活性排序与剂量摸索；CLSI M45 对 Hp 的参考方法仍是琼脂稀释法，因此用于申报、临床 S / R 判读或需要绝对可追溯 MIC 的项目，应以第三节方法复核。三类干扰必须靠对照排除：①受试物自身带色（植物提取物、中药、多酚类）掩盖或模拟颜色变化；②还原性成分（抗坏血酸、硫醇、多酚、高浓度葡萄糖 / DMSO 等）在无细胞条件下直接还原染料，造成假「生长」；③接种量过高或显色过久使试卤灵继续还原为无色，造成假「抑制」。此外培养基 pH 低于约 6.5 时刃天青本身转为橙色，Hp 尿素酶产氨及微需氧气氛亦会改变还原电位，故 pH、气体条件与判读时刻须在 SOP 中固定。除刃天青外，也有以 Christensen 尿素显色（黄→紫，利用 Hp 强尿素酶活性）作为第二步确认的比色方案，可提高对污染菌与弱生长造成假阳 / 假阴性的辨识力。

刃天青显色法 96 孔板幽门螺杆菌 MIC 实测照片 — 图 4　刃天青（resazurin / Alamar Blue）显色的 96 孔板局部（可见列号 7–12 与行号标记）：首行 7–9 列呈蓝紫色，为刃天青未被还原，提示该浓度下菌生长受抑；粉红 / 品红孔为活菌代谢将其还原为试卤灵；下方灰白近无色孔提示进一步还原为二氢试卤灵或染料褪色，须结合对照判读。本图为实测显色照片，未标注浓度与样品布局，不据此给出具体 MIC 数值。

孔内颜色	染料状态	判读要点
蓝紫 / 深蓝	氧化态刃天青，未被还原	无活菌代谢活性 → 该浓度下生长受抑，MIC 判读的终点色
粉红 / 品红	已还原为试卤灵（resorufin）	存在活菌代谢 → 生长
灰白 / 近无色	继续还原为二氢试卤灵，或染料褪色 / 孔内本底	不可单独判为抑制，须结合生长对照与无细胞空白复核

五、MBC 测定：NC 膜转印 + BHIS 平板复苏

MIC 只回答「是否抑制」，最小杀菌浓度（MBC）回答「是否真正杀死」。本服务收集 MIC、2MIC、4MIC、8MIC 等浓度组 NC 膜上的菌体，涂布至 BHIS 平板，微需氧培养后观察是否仍有可复苏菌落，据此判定 MBC。该方法避开了 Hp 液体浊度不可靠的问题，把「抑制」与「杀灭」分开验证，同时可同步留存平板照片与菌落计数，便于候选物之间的横向比较。

MBC 验证平板可见复苏菌落 — 图 5　MBC 验证（低浓度组）：NC 膜菌体涂布 BHIS 平板后仍可见可复苏菌落。

MBC 验证平板无复苏菌落 — 图 6　MBC 验证（高浓度组）：随药物浓度升高，BHIS 平板上可复苏菌落显著减少，用于判定 MBC。

六、扫描电镜（SEM）形态学验证

以 ATCC 26695 为对象，正常对照组菌体呈杆状或螺旋状、细胞壁完整；药物处理组可见部分菌体破裂或皱缩，并伴随菌体内容物释出。SEM 为 MIC / MBC 数值提供直观的细胞壁 / 膜损伤佐证，特别适用于抗菌机制研究、候选化合物复筛与作用方式推断。

扫描电镜正常组幽门螺杆菌形态 — 图 7　SEM 正常对照（ATCC 26695）：菌体呈杆状或螺旋状，细胞壁完整（标尺 2 µm）。

扫描电镜药物处理组幽门螺杆菌形态 — 图 8　SEM 药物处理组：部分菌体破裂或皱缩，伴菌体内容物释出（标尺 2 µm）。

七、细胞侵染试验：从「抑制生长」到「阻断宿主互作」

MIC / MBC 回答的是「药物能否抑制或杀灭游离菌」，但 Hp 的致病性还依赖对胃黏膜上皮的黏附、CagA 毒力蛋白递送与随之而来的炎症反应。候选物因此需要再过一层宿主细胞水平的验证：是否减少细菌黏附 / 侵入、是否降低 IL-8 等促炎因子、是否减轻 CagA 介导的细胞形态改变，同时确认受试物本身对胃上皮细胞没有明显毒性。

体系采用 AGS、GES-1、MKN-45 等人源胃上皮细胞单层，按项目设定感染复数（MOI，文献常用 50–200，典型为 100:1）与共培养时长（数小时至 24 h），在微需氧条件下与 Hp 共孵育，并设置未感染对照、细菌对照与阳性药对照。黏附与侵入用庆大霉素保护试验区分：漂洗去除未黏附菌后以庆大霉素清除胞外菌，再用皂苷裂解细胞、平板计数 CFU，分别得到「细胞总结合菌」与「胞内 / 侵入菌」。需要说明的是，Hp 传统上被视为胞外菌，但已有研究证实其可少量进入胃上皮细胞，该指标用于机制与药效比较，不用于判定其为胞内病原体。

常用终点包括：IL-8 及 TNF-α / IL-1β 等炎症因子（ELISA / qPCR）、CagA 经 cagPAI 编码的Ⅳ型分泌系统（T4SS）注入细胞后引起的肌动蛋白重排与「蜂鸟表型」（hummingbird phenotype，细胞拉长 / 散射）比例、F-actin 与 CagA 免疫荧光、细胞活力与膜损伤（CCK-8 / LDH）、细胞凋亡及紧密连接蛋白（ZO-1 / Occludin）表达。cagA 阳性且携带完整 cagPAI 的菌株通常诱导更高的 IL-8 与更明显的形态改变，因此试验菌株的毒力基因型须在方案中明确。

幽门螺杆菌胃上皮细胞侵染试验流程示意 — 图 9　Hp–胃上皮细胞共培养 / 侵染试验流程示意（非实验结果）：细胞准备 → MOI 共培养 → 庆大霉素保护试验区分黏附与侵入 → 炎症因子、形态与活力终点；具体参数以项目 SOP 为准。

八、SS1 小鼠定植模型：体内定植与药效验证

体外数据最终需要体内验证。SS1（Sydney strain 1）是 Lee 等 1997 年建立的小鼠适配株，cagA / vacA 阳性，在 C57BL/6 小鼠胃内可稳定达到 10⁶–10⁷ CFU/g 组织，体外连续传代 20 次仍保持定植能力，是疫苗评价、化合物筛选与致病机制研究的标准模型。国内研究亦显示 C57BL/6 接种 SS1 后 4、8、12 周感染率可达 100%，定植以胃窦及胃窦 / 胃体交界为主。

常规造模：SPF 级 C57BL/6（或 BALB/c）小鼠适应性饲养后，经禁食与碳酸氢钠中和胃酸预处理，以 10⁸–10⁹ CFU/mL 的 SS1 菌悬液隔日灌胃 3–5 次（约 0.2–0.5 mL / 只）；末次接种后约 4 周可确认定植，8–12 周形成慢性活动性胃炎，长期观察（约 8 个月）可进展至腺体萎缩。药效试验一般设空白对照、模型对照、阳性药对照与受试物剂量组，给药时机（预防 / 治疗）与周期按方案约定。

模型确认与药效终点采用多维指标：快速尿素酶试验（RUT）、胃组织匀浆选择性平板计数（CFU/g 是判定定植与清除的核心指标）、Giemsa / Warthin-Starry 银染观察定植密度、种特异 PCR / qPCR、H&E 病理并按 updated Sydney 系统对中性粒细胞 / 单核细胞浸润、萎缩与肠化生评分、血清抗 Hp IgG，以及组织炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 / IL-8）与氧化应激指标（MPO、MDA、SOD、GSH）。血清 IgG 仅作为感染佐证，不作为清除药效的判定依据。

模型边界与合规：SS1 模型适合定植动力学、抑菌 / 根除药效、疫苗与宿主免疫机制研究；文献汇总显示该模型即使长期观察也不形成胃癌、肠化生或异型增生，因此不适用于胃癌或癌前病变建模（此类需求应另选蒙古沙鼠长期感染或化学诱导方案）。所有动物实验须经 IACUC / 实验动物伦理委员会批准、在具备相应资质的 SPF / BSL-2 级设施内开展，并遵循 ARRIVE 2.0 报告规范。本模块按委托方项目协议联合合规动物平台实施，动物品系、数量、周期、给药方案与伦理文件在立项阶段由双方确认。

图 10　SS1 小鼠定植模型时间轴示意（非实验结果）：灌胃造模 → 4 周定植确认 → 8–12 周炎症表型 → 给药与终点评价；须经伦理审批并在合规设施内实施。

九、服务模块与交付内容

模块	方法要点	交付内容
培养与鉴定	微需氧血平板复苏、16S rRNA 一代测序、生化与染色鉴定	菌株身份与纯度记录、复苏照片
MIC（参考法）	固体含药二倍稀释法，二倍浓度梯度＋生长 / 溶剂 / 阳性药对照	各受试物 MIC 值（mg/L）、含药平板原始照片
MIC（高通量）	刃天青显色 96 孔板肉汤微量稀释，蓝紫 / 粉红颜色判读＋酶标定量（可选）	各受试物 MIC 值、显色板原始照片与读数；含生长 / 无菌 / 溶剂 / 药物颜色空白对照记录
MBC	MIC–8MIC 组 NC 膜菌体转印 BHIS 平板，微需氧复苏	MBC 判定、复苏菌落计数与平板照片
形态学	扫描电镜，正常组 / 药物处理组平行对照	SEM 原始图、细胞壁完整性描述
细胞侵染	AGS / GES-1 共培养，MOI 50–200，庆大霉素保护试验	黏附 / 侵入 CFU、IL-8 等炎症因子、蜂鸟表型比例、细胞活力与毒性
SS1 小鼠模型	SPF C57BL/6 灌胃造模，RUT / CFU per g / H&E 病理	胃内 Hp 载量、updated Sydney 评分、组织炎症因子、伦理批件与原始记录
扩展模块	Time-kill 杀菌曲线、FIC 联合药敏、耐药相关基因（23S rRNA / gyrA / rdxA 等）PCR 与测序、生物膜评价	按项目方案单独约定

十、典型应用场景

抗菌肽、小分子、植物提取物 / 天然产物的抗 Hp 活性初筛与复筛；
候选物数量多、样品量有限时，先用刃天青显色 96 孔板做批量活性排序与剂量摸索，再以琼脂稀释法复核候选 MIC；
口腔护理、胃部护理产品及消毒剂配方的体外效力比较；
医用材料、器械涂层、敷料的抑菌性能评价；
与标准药物（阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星等）并行对照，评估候选物的相对活性；
评价受试物对 Hp 黏附 / 侵入、CagA 介导炎症及胃黏膜屏障的影响（胃黏膜保护、抗炎、抗黏附方向）；
「体外 MIC / MBC → 细胞抗炎抗黏附 → SS1 模型胃内载量」三段式递进评价，用于候选物立项、复筛与研发资料准备；
结合耐药基因分型分析表型—基因型一致性，或为疫苗、益生菌、联合用药方案提供体内外关联数据。

十一、适用范围与声明

本服务为科研与研发用途的体外及动物实验评价，不构成临床诊断、治疗建议或个体化用药依据；默认不给出临床敏感 / 耐药判读结论，除非委托方案明确指定采用的折点标准与版本。涉及临床分离株或人体来源样本的项目，须由委托方提供相应伦理审查与生物安全资质；涉及实验动物的模块须取得 IACUC / 伦理批件并在合规设施内实施，动物方案、数量与终点以双方批准的项目协议为准。所有数据以实测原始记录交付，不承诺特定抑菌、杀菌或体内药效结果。菌株、药物、浓度梯度、MOI、培养条件、动物品系与周期均以双方确认的项目方案（SOP）为准。刃天青显色法读取的是代谢活性而非活菌数，须设置无细胞的「受试物＋染料」空白以排除自身颜色与还原性干扰，关键 MIC 建议以琼脂稀释法复核。页面中的流程与时间轴图为方法学示意，96 孔板照片为显色示例且未标注浓度，均非可直接引用的 MIC 结果。

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